随着单细胞测序（single-cell sequencing）技术逐渐应用于科研，临床和制药的研究中，每个月平均发表的相关文章高达100多篇，那么在单细胞测序应用最多的肿瘤领域，各位专家都是怎么用这个技术在相关领域深入探究的呢？我们选取了部分文章，来和大家一起了解一下。

第一篇 解析肿瘤药物毒副作用机制

文章标题：Intermittent PI3Kδ inhibition sustains anti-tumour immunity and curbs irAEs
发表期刊：Nature
DOI：10.1038/s41586-022-04685-2

研究思路：

这项研究的主要目的是了解PI3Kδ抑制剂的免疫系统相关毒副作用的深层机制。

为了分析PI3Kδ抑制剂对肿瘤微环境的影响，作者首先收集PI3Kδ抑制剂实体瘤临床试验中的患者样本，进行了全肿瘤RNA测序、免疫组化及肿瘤浸润CD8+T细胞的RNA测序，发现PI3Kδ抑制剂可以改变肿瘤微环境。

接下来，作者通过小鼠实体瘤模型，进一步分析PI3Kδ抑制剂副作用的机制。作者检测了小鼠不同器官中Treg的水平，发现脾脏和肠道中Treg水平均明显下降。

由于患者中的药物毒副作用在消化道中表现最为严重，因此作者推测肠道中的Treg可能对PI3Kδ抑制剂最敏感。为检验这一假设，作者对患者的肿瘤浸润T细胞和小鼠模型的消化道Treg细胞进行了单细胞测序，发现肠道中特定Treg亚群对PI3Kδ抑制剂高度敏感。PI3Kδ抑制剂用药后，由于失去了Treg的调控，机体引起肠炎。

为了进一步确定PI3Kδ抑制剂与肠炎的关系，作者建立了小鼠模型，发现与对照组相比，给药组小鼠肠炎更为严重。

最后，作者探索了如何通过调整给药频次来降低毒副作用。作者测试了持续给药和间歇给药两种方式，发现间歇给药可以在一定程度上降低毒副作用，为临床用药提供了可能的改进方法。

总结：

这篇文章用单细胞测序结合了bulk RNA seq、免疫组化、动物模型等多种方法，为分析PI3Kδ抑制剂的毒副作用机制提供了多个层面的证据。同时，在单细胞测序方面，作者不仅进行了临床样本的单细胞测序，也对小鼠模型样本进行单细胞测序分析，使得研究能够兼顾临床证据和深入的机制分析。最后，作者还探索并验证了解决毒副作用问题的可能方法，做到了研究“从临床中来，到临床中去”，进一步提升了研究的临床价值。

第二篇 分析肿瘤免疫微环境

文章标题：Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation
发表期刊：Nature
DOI：10.1038/s41586-022-04718-w

研究思路：

这项研究探讨的的是癌细胞“策反”T细胞，保护实体瘤免受免疫攻击。

作者收集了非恶性的口腔炎症组织，以及头颈鳞癌患者的肿瘤组织和外周血样本，对其中的T细胞和抗原提呈细胞进行了流式分析和高通量单细胞测序。
这么一来，作者发现，虽然肿瘤组织中的大多数免疫细胞在非恶性的炎症组织中也都存在，但一种特殊的Treg细胞，是肿瘤组织所独有的。
这种Treg细胞具有比一般Treg细胞更强的免疫抑制能力，可以保护肿瘤组织中的癌细胞，让癌细胞免遭其它免疫细胞的攻击。
相比其它Treg细胞，这种Treg细胞的特征是会表达同时表达ICOS受体和IL1R1受体——一般的Treg细胞基本不会同时表达这两种受体，因此可以用这两种受体作为标志物，筛选出这种特殊的Treg细胞。
最后，作者还通过单细胞公共数据集，确定这种Treg细胞不仅仅在头颈鳞癌中有，在其它实体瘤中也有存在——这也许会成为未来实体瘤治疗的突破点。

这篇文章的思路很巧妙，研究的是恶性肿瘤中浸润的免疫细胞，而其对照用的是非恶性的炎症组织——很多其它的肿瘤单细胞测序研究往往会用癌旁或者正常组织作为对照，这篇文章的对照选择无疑为我们拓展了新的思路，为从一般炎症相关模式中提取疾病特异性变化提供了可参考的优秀实例。

同时，作者也采用了多种研究手段，除单细胞测序外，还有流式分析、体外免疫刺激和免疫抑制实验、细胞因子分析、人源化小鼠模型等方法，这让文章拥有了各个不同层面和角度的证据，丰富全面。而且，文章最后还把重点发现拓展到了其它实体瘤中，进一步提升了其发现的生物学意义。

第三篇 理解癌症发生机制

文章标题：Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer
发表期刊：Nature Genetics
DOI：10.1038/s41588-022-01088-x

研究思路：

这项研究关注从健康结肠到浸润性结直肠癌过程中的癌症发生机制。因此，作者对健康结肠、腺瘤性息肉和结直肠癌样本分别进行了snRNA-seq（单细胞核转录组测序）和scATAC-seq（单细胞ATAC测序），绘制了肿瘤发生发展过程中的基因表达调控和转录组变化。

首先，作者对不同类型样本中的细胞类型进行了分析，发现Treg细胞在肠息肉和结直肠癌中均有富集，但仅结直肠癌样本中存在耗竭T细胞富集。

同时，肠息肉和结直肠癌中还存在着非常不同的成纤维细胞亚型，可能在癌前病变的肿瘤发生中发挥作用。

研究人员还发现，肠息肉和结直肠癌样本中的上皮细胞里富含干细胞样上皮细胞，这是健康肠道样本里所没有的，作者认为这些干细胞样上皮细胞可能代表着组织中的“癌症”干细胞。随着疾病恶性程度的加深，样本中干细胞的比例也逐渐增大。

随后，作者将肠息肉和结直肠癌样本中的干细胞样细胞与正常干细胞的基因表达和染色质可及性进行比较，发现干细胞样细胞和正常干细胞间的差异随着细胞恶性程度的增加而增加。同时还发现了一系列表达随细胞恶性程度加深而变化的基因，如ASCL2, HNF4A, GPX2等。

最后，作者结合TCGA中的正常样本和结直肠癌样本甲基化数据，对单细胞测序数据进行了更为深入的挖掘，揭示了具有早期染色质可及性变化的结直肠癌甲基化位点。

这是一篇以单细胞测序及其分析为主的文章，不涉及任何湿实验验证。但这并不影响这篇文章的内容丰富程度——它利用单细胞多组学技术，辅以大量深入的生信分析，从转录组和表观遗传调控两个层面对数据进行了深入挖掘，对细胞亚群、功能机制，以及癌前病变的进展过程，都提出了很有意义的洞见。同时，和TCGA甲基化测序数据的联合分析，进一步拓展了文章的视角和深度。

第四篇 挖掘肿瘤浸润淋巴细胞特征

文章标题：An activation to memory differentiation trajectory of tumor-infiltrating lymphocytes informs metastatic melanoma outcomes
发表期刊：Cancer cell
DOI：10.1016/j.ccell.2022.04.005

研究思路：

这项研究关注的是肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），通过单细胞转录组测序结合bulk RNA seq，对TIL进行了系统性的分析，总结了持久存在的驻留记忆TIL细胞的特征，并发现了和黑色素瘤预后相关的signature。

作者首先利用bulk RNA seq公共数据集，分析了多种器官病毒感染后的T细胞亚群，建立了对T细胞在免疫反应中“基准”状态的认知，为后续实验提供了可对比的基线。

随后，作者通过单细胞转录组测序，对13名转移性黑色素瘤患者中得到的1500个TIL进行了分析，发现约2/3的TIL都具有驻留记忆T细胞的特征，并高表达免疫检查点基因、免疫激活标志物基因，以及组织驻留相关的特征性基因。

作者进一步对比了对PD-1抗体药物响应和不响应的单细胞黑色素瘤患者样本，建模发现：对药物无响应的患者，样本中激活的TIL较多；而对药物有响应的患者，样本中存在着高比例的记忆/驻留记忆T细胞。

激活的TIL亚群和由病毒或疫苗导致的T细胞状态很是相似，同时作者也发现在其它癌种中也同样存在，是一个保守的机制。

而持久存在的驻留记忆T细胞，其siganature是潜在的黑色素瘤预后标志物，可以再TCGA中很好地对患者进行分层，将预后好和预后差的患者区分开来。因此，这个标志物也许未来可以应用于临床，对患者进行分层管理和治疗。

这也是一篇以单细胞测序分析为主的文章。不过，作者创新性地将系统生物学的研究方法与单细胞转录组测序相结合，从多个角度进行了全面深入的分析，这是值得参考的思路。同时，作者也通过TCGA数据库，为临床提供了可能的应用点，这也进一步提升了文章的档次。

总结：

通过以上的几篇高分文章，我们可以发现，它们最明显的共同特征是：用到了多种的方法论。

前两篇重实验验证，整合了多种多样的实验手段，力求多角度提供支持证据。

后两篇重生信分析，不仅进行了多种生信分析，同时也通过多组学的方式，丰富了证据的视角。此外，这两篇文章都利用TCGA数据库进行了更加深入的挖掘，让文章更上一层楼——这也是擅长干实验的老师可以借鉴的方式。

总之，要想文章发的好，方法多样不能少。不过，这并不意味着我们必须把已有的实验方法或生信分析流程全部做个遍，而是可以根据自己的长项（如更擅长湿实验中的各种实验方法，还是更擅长干实验中的各类生信分析），选择最能发挥自身优势的实验设计。