单核转录组测序，是基于单核开展的转录组测序研究。通过抽提样本的细胞核获得单核悬液，经过DAPI染色，在荧光显微镜下观察单核的完整度及亮度，从而评估单核的质量，并对符合质量检测要求的细胞核开展转录组研究的方法。

目前， Sun等^[1] 、Neumann等^[2]，Farmer等^[3] 都已经利用植物snRNA-seq发表了相关高分文章，这些研究成果的发表有力论证了单核转录组测序在植物研究中的可行性和可靠性。同时，也从侧面表明了植物snRNA-seq研究具有一定的优势。相比于原生质体的scRNA-seq，植物snRNA-seq优势明显。

高质量单核悬液制备耗时短，效率高

单细胞悬液制备时间的长短影响实验效率。由于细胞壁的存在，植物一直都依赖于酶解消化细胞壁来制备原生质体，从而开展scRNA-seq研究。然而，细胞壁往往要经过1-2 h的酶解，长时间的酶解降低了实验的效率。

相比之下，单核悬液制备更加简单，快速。单核悬液制备包括收获组织、组织破碎、制备粗核、纯化粗核、镜检几个过程。物理破碎（研磨法和刀切法）是单核悬液制备的常用方法，几min内即可快速释放单核，这极大的缩短了单核悬液的制备时间，提高了实验效率。

此外，细胞核具有双层膜结构且核的尺寸较小，因此细胞核膜坚固且不易破碎，从而更容易获得高质量的单核悬液。

样本要求低，适用于更加广泛的组织

原生质体虽然是植物单细胞悬液制备的常用方法，但并非所有的组织样本都能够成功获得原生质体。想要获得完整且细胞活率较高的原生质体，一般要求样本新鲜且幼嫩。这是因为酶解法制备原生质体的过程中，不新鲜或者不幼嫩的样本纤维化严重，解离困难，获得的原生质体得率和细胞活率都相对较低。然而，在研究过程中，很难及时对获得的新鲜样本开展单细胞研究，获得的样本也不总是幼嫩部位，这导致很多植物组织不能开展单细胞方面的研究。 相比于原生质体，单核制备对样本的要求相对较低。基于单细胞核开展的snRNA-seq研究，其物理破碎制备单核的方案不仅适用于能够及时获得的新鲜样本，而且对于冷冻储存的样本也十分友好。此外，对于一些结构较为复杂或者纤维化较为严重的组织，如花、果、茎等，也很容易通过物理破碎的方法制备获得单核悬液，从而开展snRNA-seq。因此，较低的样本要求使snRNA-seq能够应用于更广泛的组织样本。

样本捕获细胞类型的偏倚性更低

在开展单细胞研究时，捕获细胞类型的偏倚性会影响研究结果的准确性。捕获细胞类型的偏倚性是指有些细胞很容易被捕获，也有些细胞难以被捕获。 酶解法消化细胞壁制备原生质体的过程中，有些细胞会对酶产生抵抗性使其细胞壁很难被酶解消化，同时有些细胞亚群难以与酶解液直接接触，因此这些细胞都难以获得原生质体，这就导致了scRNA-seq捕获的细胞类型具有一定的偏倚性。相比之下，snRNA-seq能够降低捕获细胞类型的偏倚性。物理破碎制备单核的方法简单粗暴，对所有的组织类型“一视同仁”，能够有效捕获各种细胞类型。比如，Farmer等^[3]研究中，拟南芥根的snRNA-seq中获得了比scRNA-seq更多的细胞亚群。

降低人为因素引入的基因表达变化

酶解法消化植物细胞壁时会对原生质体产生胁迫反应。对植物产生伤害的环境称作逆境，又叫胁迫，而酶解消化细胞壁的过程就是一种胁迫反应。 细胞处于酶解条件时，原有的生活条件发生改变，其往往会通过基因的表达变化做出一系列的应激反应以适应该胁迫条件，此时的基因表达变化属于人为因素引入的转录偏差。因此酶解法制备原生质体可能会带来人为因素引起的基因表达变化。 然而，单核转录组获得的是某一时刻基因的表达情况，不会因为外界条件的改变而导致基因的表达发生变化，故snRNA-seq能够降低人为因素引入的基因表达改变，获得的基因表达水平更加接近于植物原本状态的表达情况。

不受细胞大小的局限性影响

目前，基于微液滴或微流控原理的技术是主要的单细胞研究方法。无论是基于哪种方法，大尺寸的细胞都更难被捕获。这是因为大尺寸的细胞容易堵塞孔道，而小尺寸的细胞更容易通过孔道，从而捕获细胞mRNA。 由于植物细胞本身的大小差异以及溶液渗透压的影响，失去细胞壁的原生质体细胞容易变大，而这些大尺寸的原生质体在上机时如果产生堵孔现象，因此通过原生质体开展的scRNA-seq会降低细胞的捕获率。而snRNA-seq受细胞核尺寸影响更小。相比于单细胞，单核尺寸更小，并且不易受到溶液渗透压等因素的影响而改变大小，因此小尺寸的单核更容易通过孔道，不容易造成堵孔的现象。因此，相比之下，snRNA-seq几乎不受细胞尺寸的局限性影响。

数据可靠

多项研究表明^[1-3]，单核转录组不仅能够获得有意义的生物学数据，而且与单细胞转录组获得的数据分析结果趋于一致，这说明了单核转录组获得数据质量的可靠性。

总结

总之，相比于植物scRNA-seq，植物snRNA-seq具有样本制备简单，实验效率高，兼容性强、适用于冷冻样本，降低人为因素引起的基因表达改变，更低的细胞类型偏倚性等优势。对于根、叶等容易制备原生质体的组织，可以优先开展单细胞转录组研究。而对于花、果、大直径细胞、非幼嫩或纤维化严重等难以制备原生质体的组织，可以选择进行单核转录组研究。

参考文献

[1] Sun G, Xia M, Li J, et al. The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata. Plant Cell. 2022 Apr 26;34(5):1890-1911.
[2] Neumann M, Xu X, Smaczniak C, et al. A 3D gene expression atlas of the floral meristem based on spatial reconstruction of single nucleus RNA sequencing data. Nature Communations. 2022 May 20;13(1):2838.
[3] Farmer A，Thibivilliers S，Ryu K H, et al.Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression inArabidopsis roots at the single-cell level. Mol Plant. 2021 Mar 1;14(3):372-383.